대학생 시절 아르바이트로 모델 일을 하던 당시 여자친구를 따라 프로필 사진을 찍어서 돌렸는데, 그 사진을 본 에이전트로부터 연락을 받고 드라마에 캐스팅이 되면서 연예계에 입문했다고 한다. 하지만 연기와 촬영 현장에 대해서는 무지한 상태였고, 진지한 마음으로 시작한 배우 생활이 아니었기에 초반에 고생을 많이 했다고 한다.

1997년 데뷔 당시 20살이었으나, 주로 청소년 드라마에서 캐스팅 섭외가 들어왔고, 실제로 EBS 청소년 드라마에 여러번 출연했다. 지금이야 몸무게를 좀 늘리고, 늘 앞머리를 올리고 다녀 실장님 전문 배우의 이미지를 갖고 있지만, 마른 얼굴에 머리를 기르고 앞머리를 내리던 20대 초반 시절 모습을 보면 왜 청소년 드라마에 자주 캐스팅됐는지 이해가 된다. 당시에는 너무 어려 보여 고민이었으나, 군대에 다녀온 후에는 나이에 맞는 역할을 맡을 수 있었다고 한다.

제대 후에는 팀장, 실장, 부장, 사장, 회장 등 각종 장(長)을 주로 맡으면서 인지도를 넓혔으며, 출세작인 자이언트에서도 역시 기획실장 역을 맡아, 훌륭히 소화하면서 대표적인 실장 전문 배우 라인에 합류하게 되었다.

이후 굳어진 실장 이미지를 탈피하기 위해, 한동안은 실장 역할인지 아닌지를 기준으로 작품을 결정했던 시기도 있었다고 한다. 실제로 자이언트 출연 이후로는 형사 출신 교수, 검사, 의사 등 사자가 들어가는 역할을 주로 맡으면서 이미지 변신을 꾀했다. 앙큼한 돌싱녀 등의 로맨틱 코미디 장르물에도 도전했다.

예능 프로그램 출연에도 의욕이 있다. 예능 프로그램에 출연할 때, 항상 '방송 분량을 확보해야겠다'는 생각으로 임한다고 한다. 2012년~2013년 남자의 자격 고정 멤버로 출연할 당시, 이경규, 김국진 등 본업이 코미디언인 대선배들 앞에서 기죽지 않고 열심히 하는 모습을 보여줬다. 2015년에는 무한도전 식스맨 특집에도 출연해, 예능 프로그램에 대한 열정을 보여줬다. 그래서 정극배우 치고는 연예대상에서의 수상 경력도 꽤 된다.

2022년에는 KBS 대하드라마 태종 이방원에 주인공 이방원 역할로 출연했다. 비록 방영 전에는 "대하드라마에 왜 주상욱이냐?", "이방원과는 어울리지 않는다."는 반응이 다수였다. 그러나 첫 장면부터 시청자들에게 높은 평가를 받았으며, 이미 완성된 철혈군주의 면모 위주로 강조한 기존 사극들의 이방원과는 달리 인간적인 고뇌와 성장하는 모습을 훌륭하게 연기했다는 반응이 다수이다.